#PCR
✅حالا بیاین قبل از ارائه ی پروتکل انجام کار یک جمع بندی کوتاه داشته باشیم. ما تا الان برای بررسی کم زن های انتخابیمون RNA ی سلول های تحت تیمارمون رو استخراج کردیم، بعدش از روی RNA باید cDNA مون رو طبق Reverse Transcriptase PCR سنتز کنیم. حالا بعد از طراحی پرایمر های مربوط به ژن مورد نظرمون با برداشتم مقدار مشخصی از cDNA واکنش PCR رو در دستگاه ترموسایکلر اغاز میکنیم.
🤓@netsaai

#PCR
📝پروتکل انجام RT-PCR :
1- cDNA 2ug
2- Primer Forward (10 μM) 1 μl
3- Primer Reverse (10 μM) 1ul
✅غلظت نهایی پرایمر هاتون برای انجام PCR باید 0.2μM باشد.
4- Taq 2x Master Mix 10 μl
5- PCR-grade H2O
✅ اب را اونفدر اضافه میکنیم که حجم نهايي واكنش 20 μl گردد.

📝 بعد از اضافه کردن مواد در ویال ، محتويات ويال را به خوبي مخلوط و در نهايت يک سانتريفيوژ کوتاه می کنیم. سپس براي هر کدام از ژنها بر اساس دماي ذوب پرايمرها برنامه PCR به دستگاه داده می شود.
👨‍🔬@netsaai

#PCR
👈حالا میرسیم به برنامه ی زمانی و دمایی که باید به دستگاه بدیم.
✅دقت کنین که هر پرایمری دمای annealing مخصوص به خودش رو داره پس ابتدا باید به کمک یک گرادیانت PCR دمای بهینه ی annealing پرایمر هاتون رو برای هر ژن در بیارین و بعد PCR اصلی رو انجام بدین.
👩‍🔬@netsaai

#PCR
⁉️حالا یک سوالی ازتون دارم مگر نه اینکه مرحله Denaturation اولیه برای جداسازی دو رشته ی DNA از همدیگره پس چرا برای cDNA که تک رشته است باز هم ما از مرحله ی اول استفاده میکنیم و دما رو بالا میبریم؟؟؟؟
🤔یکمی فکر کنین چه اتفاقی میتونه این وسط بیوفته که ما احتیاج به واسرشته کردن توالی داشته باشیم؟
✅جوابش اینه 👈👈👈 cDNA تک رشته ممکنه دچار شکل گیری ساختار های ثانویه بشه یعنی نواحی مکمل هم بر روی توالی ، روی هم بیفتن و ساختار های ثانویه ایجاد کنن از طرفی ممکنه در همون ابتدا پرایمر ها به هم متصل بشن و یا اتصالات نادرست ایجاد کنن.. ما دما رو در ابتدا بالا میبریم تا هم cDNA مون خطی بشه و هم پرایمر ها از هم جدا بشن تا خطا در انجام کارمون پایین بیادو
🤓متوجه شدین؟؟ این سوال رو خیلی از اساتید ممکنه ازتون بپرسن پس خوبه که بلد باشین..
📚@netsaai

#PCR
👩‍🔬راستی یه موضوع رو فراموش نکنین اون هم استفاده از ژن های کنترلیه.. بیان این ژن ها در بین نمونه های تیمار و کنترلتون نباید زیاد با هم تفاوت داشته باشه پس باید روی ژۀ باند های تقریبا یکسانی ببینین. از این ژن های کنترلی housekeeping عموما برای normalize کردن داده ها و مقایسه ی نتایج استفاده میکنیم..
👩‍🔬دقت کنین بهتره که برای هر ژن و بازه ی زمانیش یک ژن housekeeping بذارین.
👈اگر در مورد ژن housekeeping سوال دارین به قسمت سنتز cDNA رجوع کنین.
🤓@netsaai

#PCR
👈همونطور که میدونین روش RT-PCR بیشتر مخصوص بررسی کیفی بیان ژن هاست. یعنی با مقایسه ی باند های هر ژن بر روی ژل اگاروز بین نمونه های تیمار و کنترل در کنار ژن housekeeping میتونیم شدت بیان یک ژن هاص رو در نمونه ها با هم مقایسه کنیم.
✅پس در پایان مرحله ی PCR باید طبق روشی که قبلا بهتون گفتم ژل 1.5 تا 2 درصد اگاروز درست کنیم . در چاهک دوم DNA Ladder رو برای مشخص کردن اندازه ی هر باندمحصول PCR میریزیم.
در چاهک بعدی نتیجه ی PCR ژن housekeeping رو run می کنیم و در چاهک بعدی نتیجه ی PCR ژن اصلیمون رو برای نمونه ی منترل و چاهک بعدی نتیجه ی PCR برای ژن اصلی در نمونه ی تحت تیمار.
👈اگر برای نمونه های تیمار شدتون بازه ی زمانی دارین هم میتونین نتیجه ی PCR یک ژن خاص در هر بازه ی زمانی رو در یک چاهک run کنین.
👩‍🔬@netsaai

#PCR
👨‍🔬پس اخرین مرحله ی انالیز کیفی بیان ژن هامون بعد از PCR ران کردن محصولات بر روی ژل اگاروزه.
👈برای اینکار پس از پایان واکنش PCR، حدود 8 میکرولیتر از محصولات PCR رو با 1 میکرولیتر از Loading dye Buffer خوب مخلوط می کنیم و به درون چاهک های ژل آگاروز 2 درصد که درون تانک الکتروفورز حاوی TAE 1X است، منتقل میکنیم. حالا با برقراری اختلاف پتانسیل، نمونه ها روی ژل حرکت می کنن. برای ظاهر سازی باندها، ژل با اتیدیوم بروماید نشاندار و با استفاده از UV transluminator مشاهده میشه و تصاویر مربوطه پرینت گرفته میشود..
🤔اگر برای ساخت ژل اگاروز سوال دارین به قسمت بررسی کیفی RNA سنتز شده برین اونجا کامل مراحل run کردن نمونه در الکتروفورز رو توضیح دادم.
📚@netsaai

#PCR
👩‍💻خوب خسته نباشین... امیدوارم کاملا تونسته باشم شما رو به مبحث PCR مسلط کنم. اما باز هم میدونم که دیدن کلیپ خیلی بیشتر از خوندن متن کمک کننده است برای همین دو تا کلیپ از مراحل انجام PCR و نحوه ی run کردنش روی ژل براتون اماده کردم که حتما ببینینش...
🎬netsaai

📝@netsaai📝
دوستان عزیزی که تازه به جمع ما پیوستن و همچنین همراهان قدیمی نت سای برای دسترسی هر چه اسانتر به مطالب اموزشی و پروتکل های مطرح شده در کانال به میتونین هشتک های زیر مراجعه نمایید:
📝پروتکل ها:
#DNA_Cloning
#Transfection
#Immunohistochemistry
#سنتز_cDNA
#Plasmid_preparation
#PCR

👈👈پروتکل تکنیک هایی وسترن بلات ، استخراج RNA و تعیین کیفیت و کمیت ان ، تست MTT ، اشنایی با تکنیک های رایج کشت سلول (پاساژ ، فریز و دفریز) ، شمارش سلول با لام هموسیتومتر ، ساخت باکتری های مستعد (Competent Cell) ، الکتروپوریشن و تکنیک ترانسفورماسیون پلاسمید در باکتری ها بدون هشتک هستند که یا میتونین در کانال دنبالش بگردین و یا به سایت ما netsaai.com قسمت پروتکل ها و یا وبلاگ مراجعه کنین...
📚مطالب اموزشی:
#RNA_Editing
#Exosomes
#CircularRNA_sequencing
#lncRNA_Sequencing
#miRNA_Sequencing
#Molecular_Cancer_Target_Therapy
#Chip_Sequencing
#مولکول_تنظیمی_miRNA
#مولکول_تنظیمی_lncRNA
#مولکول_تنظیمی_CircularRNA

موضوعات Pyrosequencing ، فلوسایتومتری ، فاکتور های مولکولی تنظیمی در بیان ژن ها ، Genome Editing ، تکنیک Crisper/cas ، مدلسازی بیماری های انسانی با استفاده از iPSC ها و مدل های Isogenic فاقد هشتک هستند که یا میتونین در کانال دنبالشون بگردین و یا میتونین به سایت ما Netsaai.com قسمت مطالب اموزشی و یا وبلاگ مراجعه کنین...

🎬برای دیدن کلیپ های اموزشی هر مطلب میتونین به کانال ، سایت نت سای و همچنین سایت اپارات ( گروه نت سای) مراجعه فرمایید.

👩‍💻ممنونیم که ما رو دنبال میکنین...
🙋لطفا ما رو از نظرات ، پیشنهادات و انتقاداتتون در راستای بهبود و ارتقای کیفیت کارمون بی نصیب نگذارید...
👈👈👈یادتون باشه که ما اینجاییم تا شما با خیال راحت و در ارامش کامل کارهای ازمایشگاهی تون رو انجام بدین و با مطالب روز دنیا اشنا بشین....
👨‍🔬📝🎬👩‍🔬@netsaai

📝@netsaai📝
دوستان عزیزی که تازه به جمع ما پیوستن و همچنین همراهان قدیمی نت سای برای دسترسی هر چه آسانتر به مطالب آموزشی و پروتکل های مطرح شده در کانال به میتونین هشتک های زیر مراجعه نمایید:
📝پروتکل ها:
#DNA_Cloning
#Transfection
#Immunohistochemistry
#Immunohistochemistry_troubleshooting
#Plasmid_preparation
#PCR
#Transduction
#سنتز_cDNA

👈👈پروتکل تکنیک هایی وسترن بلات ، استخراج RNA و تعیین کیفیت و کمیت آن ، تست MTT ، آشنایی با تکنیک های رایج کشت سلول (پاساژ ، فریز و دفریز) ، شمارش سلول با لام هموسیتومتر ، ساخت باکتری های مستعد (Competent Cell) ، الکتروپوریشن و تکنیک ترانسفورماسیون پلاسمید در باکتری ها بدون هشتک هستند که یا میتونین در کانال دنبالش بگردین و یا به سایت ما netsaai.com قسمت پروتکل ها و یا وبلاگ مراجعه کنین...
📚مطالب آموزشی:
#RNA_Editing
#Exosomes
#CircularRNA_sequencing
#lncRNA_Sequencing
#miRNA_Sequencing
#Molecular_Cancer_Target_Therapy
#Chip_Sequencing
#Epigenetic_and_cancer
#مولکول_تنظیمی_miRNA
#مولکول_تنظیمی_lncRNA
#مولکول_تنظیمی_CircularRNA

موضوعات Pyrosequencing ، فلوسایتومتری ، فاکتور های مولکولی تنظیمی در بیان ژن ها ، Genome Editing ، تکنیک Crisper/cas ، مدلسازی بیماری های انسانی با استفاده از iPSC ها و مدل های Isogenic فاقد هشتک هستند که یا میتونین در کانال دنبالشون بگردین و یا میتونین به سایت ما Netsaai.com قسمت مطالب اموزشی و یا وبلاگ مراجعه کنین...

🎬 ما برای درک بهتر موضوع سعی کردیم برای هر عنوان یک یا چند کلیپ آموزشی قرار بدیم که شما برای دیدن کلیپ های آموزشی هر مطلب میتونین به کانال ، سایت نت سای و همچنین سایت اپارات ( گروه نت سای) مراجعه فرمایید.

👩‍💻ممنونیم که ما رو دنبال میکنین...
🙋‍♀️لطفا ما رو از نظرات ، پیشنهادات و انتقاداتتون در راستای بهبود و ارتقای کیفیت کارمون بی نصیب نگذارید...
👈👈👈یادتون باشه که ما اینجاییم تا شما با خیال راحت و در ارامش کامل کارهای آزمایشگاهی تون رو انجام بدین و با مطالب روز دنیا آشنا بشین....
👨‍🔬📝🎬👩‍🔬@netsaai

‍ #PCR
#REAL_TIME_PCR
🔎@netsaai🔍

✅تکنیک REAL TIME PCR با بررسی دقیق میزان بیان ژن هدف چه به صورت مطلق و چه به صورت نسبی راهکار بسیار مناسبی برای بررسی تغییرات بیان ژن ها در نمونه های مورد آزمایش است.
👈با در نظر گرفتن نقش پررنگ این تکنیک در بین کارهای آزمایشگاهی دونستن دقیق اینکه این تکنیک دقیقا چیه و چکار میکنه، چه فرقی با PCR معمولی داره و روش تفسیر منحنی هاش چطوریه کمک بسیار بزرگی به درک هر چه بهتر این تکنیک میکنه.
👩‍💻پس اگر میخواین کامل و جامع در مورد این تکنیک بدونین بهتون پیشنهاد می کنم که یک سر به سایت www.netsaai.com قسمت پروتکل های مولکولی بزنید. اونجا ما به طور کامل این تکنیک رو با تمام متعلقاتش توضیح دادیم.
🎬اگر هم اون مطلب رو خوندین کلیپ زیر نکاتی که در سایت خوندین رو به صورت تصویری بهتون توضیح میده.
📈@netsaai📉
🙋‍♀️راستی تا یادم نرفته بگم نت سای کلاس های خصوصی و گروهی برای یادگیری آنالیز داده های REAL TIME از ابتدا تا آماده سازی داده ها برای مقاله و پایان نامه برگزار میکنه. اگر خواستین شرکت کنین حتما با ادمین تماس بگیرید.
🔎@netsaai🔍

‍ #PCR
#REAL_TIME_PCR
🔎@netsaai🔍

✅تکنیک REAL TIME PCR با بررسی دقیق میزان بیان ژن هدف چه به صورت مطلق و چه به صورت نسبی راهکار بسیار مناسبی برای بررسی تغییرات بیان ژن ها در نمونه های مورد آزمایش است.
👈با در نظر گرفتن نقش پررنگ این تکنیک در بین کارهای آزمایشگاهی دونستن دقیق اینکه این تکنیک دقیقا چیه و چکار میکنه، چه فرقی با PCR معمولی داره و روش تفسیر منحنی هاش چطوریه کمک بسیار بزرگی به درک هر چه بهتر این تکنیک میکنه.
👩‍💻پس اگر میخواین کامل و جامع در مورد این تکنیک بدونین بهتون پیشنهاد می کنم که یک سر به سایت www.netsaai.com قسمت پروتکل های مولکولی بزنید. اونجا ما به طور کامل این تکنیک رو با تمام متعلقاتش توضیح دادیم.
🎬اگر هم اون مطلب رو خوندین کلیپ زیر نکاتی که در سایت خوندین رو به صورت تصویری بهتون توضیح میده.
📈@netsaai📉
🙋‍♀️راستی تا یادم نرفته بگم نت سای کلاس های خصوصی و گروهی برای یادگیری آنالیز داده های REAL TIME از ابتدا تا آماده سازی داده ها برای مقاله و پایان نامه برگزار میکنه. اگر خواستین شرکت کنین حتما با ادمین تماس بگیرید.
🔎@netsaai🔍

‍ #PCR
#REAL_TIME_PCR
🔎@netsaai🔍

✅تکنیک REAL TIME PCR با بررسی دقیق میزان بیان ژن هدف چه به صورت مطلق و چه به صورت نسبی راهکار بسیار مناسبی برای بررسی تغییرات بیان ژن ها در نمونه های مورد آزمایش است.
👈با در نظر گرفتن نقش پررنگ این تکنیک در بین کارهای آزمایشگاهی دونستن دقیق اینکه این تکنیک دقیقا چیه و چکار میکنه، چه فرقی با PCR معمولی داره و روش تفسیر منحنی هاش چطوریه کمک بسیار بزرگی به درک هر چه بهتر این تکنیک میکنه.
👩‍💻پس اگر میخواین کامل و جامع در مورد این تکنیک بدونین بهتون پیشنهاد می کنم که یک سر به سایت www.netsaai.com قسمت پروتکل های مولکولی بزنید. اونجا ما به طور کامل این تکنیک رو با تمام متعلقاتش توضیح دادیم.
🎬اگر هم اون مطلب رو خوندین کلیپ زیر نکاتی که در سایت خوندین رو به صورت تصویری بهتون توضیح میده.
📈@netsaai📉
🙋‍♀️راستی تا یادم نرفته بگم نت سای کلاس های خصوصی و گروهی برای یادگیری آنالیز داده های REAL TIME از ابتدا تا آماده سازی داده ها برای مقاله و پایان نامه برگزار میکنه. اگر خواستین شرکت کنین حتما با ادمین تماس بگیرید.
🔎@netsaai🔍

‍ #PCR
#REAL_TIME_PCR
🔎@netsaai🔍

✅تکنیک REAL TIME PCR با بررسی دقیق میزان بیان ژن هدف چه به صورت مطلق و چه به صورت نسبی راهکار بسیار مناسبی برای بررسی تغییرات بیان ژن ها در نمونه های مورد آزمایش است.
👈با در نظر گرفتن نقش پررنگ این تکنیک در بین کارهای آزمایشگاهی دونستن دقیق اینکه این تکنیک دقیقا چیه و چکار میکنه، چه فرقی با PCR معمولی داره و روش تفسیر منحنی هاش چطوریه کمک بسیار بزرگی به درک هر چه بهتر این تکنیک میکنه.
👩‍💻پس اگر میخواین کامل و جامع در مورد این تکنیک بدونین بهتون پیشنهاد می کنم که یک سر به سایت www.netsaai.com قسمت پروتکل های مولکولی بزنید. اونجا ما به طور کامل این تکنیک رو با تمام متعلقاتش توضیح دادیم.
🎬اگر هم اون مطلب رو خوندین کلیپ زیر نکاتی که در سایت خوندین رو به صورت تصویری بهتون توضیح میده.
📈@netsaai📉
🙋‍♀️راستی تا یادم نرفته بگم نت سای کلاس های خصوصی و گروهی برای یادگیری آنالیز داده های REAL TIME از ابتدا تا آماده سازی داده ها برای مقاله و پایان نامه برگزار میکنه. اگر خواستین شرکت کنین حتما با ادمین تماس بگیرید.
🔎@netsaai🔍

سلام به همگی 🤓🖐
خیلی ممنونیم که در نظرسنجی شرکت کردین و به ما گقتین که با تکنیک RealTimePCR شروع کنیم ولی خوب خیلی از دوستان خواستند که PCR رو از اول باهم برسی کنیم پس با ما همراه باشید 😃🍀


#RealtimePCR #PCR
🔗 آدرس سایت: Rtpmed.com

خوب RealtimePCR چیست؟ 🤔
امروزه روش‌های تکثیر و تشخیص اسید‌های نوکلئیک از ارزشمندترین ابزارهای تحقیقات بیولوژیکی هستند. دانشمندان در تمام زمینه های علوم زیستی مثل تحقیقات پایه، بیوتکنولوژی، پزشکی، پزشکی قانونی، تشخیص و غیره، از این روش ها در طیف گسترده ای از کاربردها استفاده می کنن. با توجه به اهمیت نقش تشخیص کمی و کیفی اسید های نوکلئیک در حوزه ی بیولوژی، تکنیک Polymerase Chain Reaction (PCR) انقلابی در این حوزه ایجاد کرد. مطمئن هستیم که همگی شما از اصول پایه ی این تکنیک کاملا آگاهی دارین برای همین ما در مقاله قصد داریم که به مواردی از این تکنیک اشاره می کنیم که دونستنشون شما رو به درک عمیق تری از این تکنیک و انواعش برسونه.
#PCR #RealTimePCR

⬅️ انواع PCR
1️⃣Common PCR
2️⃣Real-time PCR
3️⃣RT PCR

Common PCR:
👈👈اول از همه میریم سراغCommon PCR (PCRمعمول) که به دلیل فرمت ساده ای که داره بیشترین مدل رایج در دانشگاه هاست. این نوع PCR اسامی دیگه ای هم داره. گاها دیده شده بهش End point PCR( PCR نقطه انتهایی)،Traditional PCR (PCR سنتی) و Conventional PCR ( PCR رایج) هم گفته میشه! این نوع از PCR به روشی برای تکثیر اسیدهای نوکلئیک گفته میشه که میاد اون RNA یا DNA مورد نظر ما رو اونقدرررر تکثیر میکنه که درنهایت ما بیشترین مقدار کپی از قطعه موردنظرمونو داشته باشیم.
🤓👈اگه بخوایم اطلاعات بیشتری وارد ماجرا کنیم، باید بگیم که در طول فرآیند این نوع از PCR، ما باید صبور باشیم چون PCR اونقدرر ادامه پیدا میکنه تا رشته قابل تکثیری که ما تو آزمایش بدنبال اون هستیم، کامل تکثیر بشه و هیچی از مواد اولیه باقی نمونه برای همین بیشترین مقدار کپی رو به ما میده. بعد از تموم شدن پروسه ی PCR برای دیدن نتیجه کار، باید اونو ببریم روی ژل الکتروفورز.
✅️ ژل آگارُز( یه ماده پلیمریه که از بعضی از جلبک های قرمز درست میشه و برای جداسازی مولکول ها استفاده میشه) DNA رو براساس سایز به قطعه های مختلفی تقسیم میکنه. هرچی قطعه کوچیکتر باشه دورتر میره. حالا یعنی چی میره؟ کجا میره؟

👈👈ما به کمک شانه های مخصوصی روی ژل چاهک درست می کنیم. حالا حدود چند میکرولیتر از محصول PCR مون رو که Loading dye مخلوط کردیم توی چاهک ها میریزیم. ژل رو میذاریم داخل تانک الکتروفورز که توش رو با بافر پر کردیم و دستگاه رو میزنیم به برق. چون به دو سمت ژل الکتروفورز جریان برق با جریان منفی و مثبت متصله انتقال جریان از منفی به مثبت ایجاد میشه. .بافری هم توی دستگاه هست رساناست و باعث انتقال جریان برق میشه.. همونطور که همگی ما میدونیم DNA دارای بار منفیه پس با ایجاد جریان برق از قطب منفی به سمت قطب مثبت روی ژل آگارز حرکت می کنه. این جریان باعث میشه که قطعات ژنی با طول ها و وزن های مختلف از هم جدا بشن و به صورت باند در مناطق مختلقفی از ژل قرار بگیرن.
✅️خب حالا باید یه معیاری برای اینکه بفهمیم این باند ها دقیقا قطعه ژنی با چه طولی هستن داشته باشیم. برای این منظور از DNA Ladder استفاده می کنیم. DNA Ladder، یک مخلوطی از انواع توالی DNA است که طولشون مشخصه و به عنوان یک الگو برای فهمیدن طول تقریبی محصول PCR مون استفاده میشه. وقتی کار الکتروفورز تموم شد، ژل رو در محلول اتیدیوم بروماید میغلتونیم و بعد با کمک UV می تونیم کامل باند های ایجاد شده رو ببینیم و تحلیل کنیم. اجازه بدین زیاد وقت برای توضیح تکنیک الکتروفورز نذاریم چون قدیمی های کانال حتما میدونن که ما قبلا کاملا این تکنیک رو در کانال توضیح دادیم. اما فکر کنم دیدن تصویر زیر هم به یادآوری نحوه ی عملکرد الکتروفورز کمک کنه. تو عکس دوم شما کاملا میتونین ببینین که وقتی قطعات ژن های هدف که با دستگاه PCR تکثیر میشن روی ژل الکتروفور چطوری ابر اساس وزن و طولشون از هم جدا میشن. ردیف 1 DNA Ladder هست که چون ما طول توالیش رو میدونیم با کمکش می تونیم طول قطعات ژن های هدفمون رو به صورت تخمینی متوجه بشیم.

🔗آدرس سایت :
RTPmed.com

#PCR
#RealTimePCR

پس ما با کمک این مدل PCR، میتونیم به سوالات زیر جواب بدیم.
1️⃣آیا قطعه ژنی که مورد نظرمون هست در نمونه ی تحت آزمایشمون وجود داره یا نه! مثلا اگر دنبال این هستین که آیا یک ژن رشد خاص توی نمونه ی سرطانی تکثیر و بیان میشه یا نه!
2️⃣ به صورت تخمینی می تونین طول قطعات ژنی مورد نظرتون رو هم بفهمین. این مسئله تو کلونینگ وقتی میخواین ژن های رو وارد وکتور خاصی بکنین خیلی کمک کننده است.
3️⃣به عکس بالا دقت کنین. میبینین میزان پهنای باند ها با هم فرق داره. هرچه باند پهن تر و پرنور تر باشه یعنی اون قطعه ژنی بیشتر تکثیر شده پس مقدارش تو سلولتون بیشتره. پس تو این روش میزان بیان ژن رو هم تا حدودی میتونین تخمین بزنین.


✅️میبینین چقدر از واژه تخمین استفاده کردم! واسه اینکه در این مدل PCR میزان سنجش بر اساس مقایسه و تخمینه و هیچ عدد و میزان دقیقی به شما داده نمیشه. پس این مدل PCR بیشتر حالت کیفی و یانهایتا نیمه کمی داره که بهش میگن Semi Quantitative.

Rtpmed.com
#realtimePCR
#pcr

❓️❓️حالا یه سوال دارم. بنظرتون از کجا میتونیم بفمیم که اگر روی ژل باند ندیدین واقعا قطعه ژنی مدنظرمون تکثیر نشده یا روشمون یا مواد مورد استفادمون مشکل داشته؟!

✅️برای اینکه اینو متوجه بشیم اول باید با مفهوم ژن های خانه دار (House Keeping Genes) آشنا بشیم. ژن های خانه دار واقعا خانه دارهستن!!! یعنی همیشه در خونه که همون سلول هست حضور دارن. چرا؟ چون حضورشون برای بقای سلول حیاتیه. مثل ژن های مربوط به آنزیم های همانندسازی، رونویسی و ترجمه.

👈توی ویکی پدیا بزنین لیست کاملی از تمامی ژن های خانه دار رو براتون میاره اما پر مصرف ترینشون تو کارهای تحقیقاتی و بالینی ژن های GAPDH، Beta actin  و RNAase P هستن.

✅️پس اگر برای این ژن ها  PCR بذاریم همیشه باید باند ببینیم و اگر نبینیم یعنی یه جای کارمون تو انجام PCR مشکل داشته. به همین دلیل خیلییی مهمن و همیشه باید در کنار قطعه ی ژنی موردنظرمون روی ژل باندشون رو ببینیم تا مطمئن بشیم که PCR رو درست انجام دادیم.

و با توجه به اینکه طول قطعه اش رو هم میدونیم راحت میتونیم روی ژل تشخیصش بدیم.

#RealTimePCR #PCR

Rtpmed.com

👈👈👈به صورت خلاصه اگر بخوام بگم در صورتی که شما روی ژلتون دو تا باند دیدین یعنی هم کارتون رو دست انجام دادین و هم ژن مورد نظرتون توی هست و تکثیر شده، اگر فقط باند ژن خانه دار رو دیدین یعنی کارتون رو درست انجام دادین ولی ژن مورد نظرتون توی سلول وجود نداره و تکثیر نشده. و در نهایت اگر اصلا هیچ باندی ندیدین باید حتما به روش انجام PCR و یا موادتون بخصوص طراحی پرایمرتون شک کنین.
🤓البته با توجه به اینکه پرایمر های طراحی شدتون برای ژن هدف و ژن خانه دار متفاوت است اگر باندی از ژن هدفتون ندیدین ممکن هست که تو طراحی پرایمر ژن هدفتون اشتباه کرده باشین اما حداقل مطمئن هستین که پروسه رو درست انجام دادین. 

✅️راستی! هنوز مواد لازم برای انجام این مدل PCR رو با هم بررسی نکردیم:
توالی پرایمر که اختصاصا برای قطعه ژنی موردنظرمون سنتز شده. (یادتون باشه که هم برای ژن هدف و هم برای ژن خانه دارتون باید پرایمر داشته باشین مستر میکس واکنش که حاوی تمام موادی است که برای انجام PCR نیازه. مثل آنزیم Taq Polymerase، تمام انواع بازهای مورد نظر DNA ( Dntp ها)و بافر و نمک های یونی لازم.
و درنهایت DNA استخراج شده از سلول هدفتون که حتما قبلش باید با دستگاه نانودراپ کیفیتش رو سنجیده باشین.
✅️دستگاه هایی همکه احتیاج داریم دستگاه ترموسایکلر PCR،  دستگاه ژل الکتروفورز و دوربین برای عکس برداری از ژلمون هست. 
چون فعلا میخوایم انواع PCR رو با هم بررسی کنیم پروسه انجام کار رو توضیح نمیدیم. اگر کسی هست اینجا که میخواد PCR معمولی بذاره و نیاز به پروتکل داره لطفا بهمون بگه تا به خاطر ایشون پروتکل کامل انجام تست PCR معمولی را بذاریم.

#PCR #RealTimePCR

Rtpmed.com